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Multiomica spazialmente risolta di nicchie cardiache umane

Jul 10, 2023

Volume della natura 619, pagine 801–810 (2023) Citare questo articolo

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La funzione di una cellula è definita dalle sue caratteristiche intrinseche e dalla sua nicchia: il microambiente tissutale in cui dimora. Qui combiniamo dati di trascrittomica unicellulare e spaziale per scoprire nicchie cellulari all'interno di otto regioni del cuore umano. Mappiamo le cellule in posizioni microanatomiche e integriamo annotazioni strutturali basate sulla conoscenza e non supervisionate. Profiliamo anche le cellule del sistema di conduzione cardiaca umana1. I risultati hanno rivelato il loro repertorio distintivo di canali ionici, recettori accoppiati a proteine G (GPCR) e reti di regolamentazione e hanno implicato FOXP2 nel fenotipo del pacemaker. Mostriamo che il nodo senoatriale è compartimentato, con un nucleo di cellule pacemaker, fibroblasti e cellule gliali che supportano la segnalazione glutamatergica. Utilizzando un modulo personalizzato CellPhoneDB.org, identifichiamo le interazioni delle cellule pacemaker transsinaptici con la glia. Introduciamo uno strumento di previsione del bersaglio drogabile, drug2cell, che sfrutta i profili di singola cellula e le interazioni farmaco-bersaglio per fornire approfondimenti meccanicistici sugli effetti cronotropi dei farmaci, inclusi gli analoghi del GLP-1. Nell'epicardio, mostriamo un arricchimento di plasmacellule sia IgG+ che IgA+ che formano nicchie immunitarie che possono contribuire alla difesa dalle infezioni. Nel complesso, forniamo nuova chiarezza all’elettroanatomia e all’immunologia cardiaca e la nostra suite di approcci computazionali può essere applicata ad altri tessuti e organi.

Il cuore è composto da tessuti distinti che contengono nicchie di tipi cellulari specializzati che conferiscono funzionalità sito-specifiche. Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) e il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo (snRNA-seq) offrono un quadro potente e imparziale per caratterizzare queste cellule2,3. L'aggiunta di trascrittomica risolta spazialmente ci consente di ripristinare le informazioni strutturali perse nelle tecniche unicellulari e di ottenere informazioni sulla funzione collettiva4,5.

Il sistema di conduzione cardiaca (CCS), responsabile dell'attivazione elettrica regolare e coordinata del cuore, contiene strutture tra cui i nodi senoatriali e atrioventricolari (rispettivamente SAN e AVN), il fascio atrioventricolare (AVB) e la rete His-Purkinje, che ospitano ciascuna cellule con proprietà elettrofisiologiche distinte6. Combiniamo dissezione mirata e istologia per generare profili trascrittomici completi di cellule CCS umane. Inoltre, utilizziamo la trascrittomica spaziale per mappare queste cellule nelle loro posizioni microanatomiche e scoprire le loro cellule partner di nicchia. Ispirati dall'ampio profilo di espressione dei recettori delle cellule pacemaker (cellule P), estendiamo il database di interazione cellula-cellula CellPhoneDB7 con un nuovo modulo neurale-GPCR. Questo modulo evidenzia le connessioni sinaptiche, comprese nuove informazioni sulle cellule gliali vicine e sulla capacità di segnalazione glutammatergica.

L'attività fuori bersaglio delle terapie non cardiache sul cuore e sul suo sistema di conduzione è una delle ragioni principali del fallimento e del ritiro dello sviluppo di farmaci8. Per aiutare ad affrontare questa sfida, sviluppiamo una pipeline, drug2cell, che integra le interazioni farmaco-bersaglio dal database ChEMBL con dati a singola cellula forniti dall'utente per valutare in modo completo l'espressione del farmaco-bersaglio nelle singole cellule. L’applicazione di questo approccio alle cellule P fornisce informazioni meccanicistiche sugli effetti cronotropi dei farmaci non cardiaci.

Infine, mostriamo che il nostro approccio multiomico integrato è in grado di scoprire una nicchia (cioè il microambiente dei tessuti cellulari). Definiamo un sistema di difesa immunitaria epicardico e una nicchia di stress miocardico ventricolare e deduciamo specifici segnali intercellulari attivi all'interno di ciascun microambiente cellulare. Queste nuove nicchie cellulari cardiache ci consentono di affinare i componenti cellulari che sono alla base della microanatomia del cuore umano.

Abbiamo integrato i set di dati scRNA-seq e snRNA-seq (sc/snRNA-seq) precedentemente pubblicati2 con dati multiomi appena generati (snRNA-seq accoppiati e test a nucleo singolo per la cromatina accessibile alla trasposasi utilizzando il sequenziamento (snATAC-seq)) e dati di trascrittomica spaziale (10x Genomica). Abbiamo studiato le seguenti otto regioni anatomiche: i ventricoli sinistro e destro (rispettivamente LV e RV), gli atri sinistro e destro (rispettivamente LA e RA), l'apice (AX), il setto interventricolare (SP), il SAN e l'AVN (Fig. 1a). In totale, i nostri dati includevano campioni di 25 donatori di età compresa tra 20 e 75 anni (Fig. 1a). Tutti i campioni di tessuto provenivano da donatori di trapianto senza storia di malattia cardiaca o aritmia (Tabella supplementare 1) e i cuori che contribuivano alle regioni SAN e AVN provenivano da donatori con parametri di conduzione normali confermati da elettrocardiogrammi a 12 derivazioni prima della donazione (Tabella supplementare 1) .

10% of P cells that are not differentially expressed (Extended Data Fig. 8e,f). c. Predicted TF network governing P cell identity. TFs (grey) and their predicted target genes (TGs) are displayed. Interactions inferred from ATAC-seq analysis are highlighted in red. For a complete list of TGs, see Supplementary Table 5. d, Inferred cell–cell (trans-synaptic) interactions between nodal cell states, with ‘receiver’ cells (post-synaptic SAN_P_cells) in red and ‘sender’ (pre-synaptic) cells in blue. LR mean, mean expression levels of the interacting ligand–receptor partners. e, Histological annotations of a SAN Visium section (FFPE) and H&E image of a RAGP. Representative of three hearts. f, Expression of neural genes in the RAGP (Visium–FFPE). g, Schematic representation of interactions in the nodal niche. P cells interact with ECM proteins (secreted by FBs) and NC2_glia_NGF+ cells, forming synapse-like connections through neurexins. NC2_glia_NGF+ cells support glutamatergic signalling and release NGF, which interacts with receptors on autonomic neurons. P cells express receptors for autonomic neurotransmitters, glutamate and angiotensin II (ATII), which is produced locally by NC2_glial_NGF+ cells and FBs. h, Immunofluorescence staining of the SAN with anti-HCN1 (pink) and anti-PLP1 (yellow) antibodies and nuclei (DAPI, blue). Arrowheads indicate colocalization of HCN1 and PLP1. Images from two independent donors (AV14 and AH6) are shown. Illustrations in a,b,d,g were created using BioRender (https://biorender.com)./p> 2, P value < 0.05, corrected using the Benjamini–Hochberg method). Heatmap colours show the values scaled to z-scores for each drug. Categories of drugs are based on the ATC classification. EC, endothelial cell. c, Schematic representation of putative cell targets for chronotropic drugs. Single-cell profiling revealed that P cells express genes encoding targets of chronotropic drugs (yellow circle), indicative of ANS-independent mechanisms, such as in the case of the GLP1 analogues and perampanel. β, β-adrenergic receptor; M2, muscarinic acetylcholine receptor M2. Illustrations in a,c were created using BioRender (https://biorender.com)./p>5 times their volume of 4% v/v formalin at ambient temperature for 24 h before processing to paraffin on a Tissue-Tek Vacuum Infiltration Processor 5 (Sakura Finetek). FFPE blocks were sectioned at 5 μm using a microtome (Leica RM2125RT)./p>

5) that had higher than a value of (0.03) were selected./p> 0) DEGs were depicted in the GPCR overview schematic (Fig. 3b). To compare the transcriptional similarity of working (aCM, vCM) and CCS cell states, a dendrogram based on principal-component-analysis-reduced gene expression was computed using the Scanpy function scanpy.tl.dendrogram (Extended Data Fig. 8c)./p> 1, adjusted P value < 0.01) for SAN_P_cells was made. Differentially expressed testing summary statistics from two mouse single-cell studies were obtained52,73. In both studies, differentially expressed testing was conducted by comparing sinoatrial CMs (P cells) against all other cells. Genes orthologous to the list of upregulated (human) P cell genes were identified in the mouse differentially expressed summary statistics (using the NCBI Orthologs database as a reference). The differentially expressed statistics (log2(fold change), –log(P value)) from the mouse are plotted. Human and mouse data were not integrated./p> 0.2 or < −0.2, FDR < 1 × 10–4) using the multiome data of aCMs. TFs and potential target gene interactions were obtained by combining the two results (Supplementary Fig. 5c). The inferred interactions are highlighted in red in the activator network graph (Fig. 3c) and blue in the repressor network graph (Extended Data Fig. 8i)./p> 0.8) based on 1000 Genomes (phase 3) European samples, obtained using the Ensembl API80,81, with the window size set to the default 500 kb./p>0). The binarized barcode by peak matrix was then aggregated by cell state (defined using the paired gene expression data) to form a cell state-by-peak matrix, in which a peak was defined as open for a given cell state if the binarized count was 1 in at least 5% of that population./p>

0.5, p-values were adjusted for multiple comparisons using the Benjamini-Hochberg method). Each niche was defined based on the NMF analysis and the corresponding spots were selected by thresholding the factor loadings (top 10% of all spots). f. Inferred spatial cell-cell interactions involving TGFβ superfamily member ligands in the node, signalling to cognate receptors in the FB4_activated cells (LR mean>0.5). LR mean (mean expressions of the interacting ligand-receptor partners). Illustrations in f were created using BioRender (https://biorender.com)./p>0, p < 0.05) encoding ion channels in any of the CCS cell states compared with the other aCMs. b. Dot plot shows the expression of P cell ion channel genes, genes encoding Connexins 45 (GJC1) and 40 (GJA5), and the potassium channel gene KCND2. c. Dendrogram comparing overall gene expression profile of working (aCMs, vCMs) and CCS cell states. d. Dot plot shows ion channel genes highly expressed in Purkinje cells compared to other vCMs. e,f. Dot plot shows the expression of the DEGs (log2FC>0, p < 0.05) encoding GPCRs (e) or G-protein complexes and RGS (f) in any of the CCS cell states compared with the other aCMs (left). Dot plot shows the genes expressed (>10%) in any of the CCS cell states (right). RGS (regulators of G-protein signalling). g,h. Inferred spatial cell-cell interactions of GPCRs (CellPhoneDB with neural-GPCR module) in the central node of SAN (g) or the ‘node’ structure of AVN (h), with P cell as the receiver. LR mean (mean expressions of the interacting ligand-receptor partners). i. Analysis of TF repressor network in P cells using pySCENIC (Methods). TFs (grey) and their predicted target genes (TGs) are displayed. Interactions inferred from snATAC-seq analysis are highlighted in blue. TG colours represent class: GPCRs (green), ion channels (blue), or TFs (yellow). For a complete list of TG see Supplementary Table 6. j. Peak-to-gene linkage plot of HCN1 (ArchR). One of the peaks linked to HCN1 has FOXP2 binding motif as indicated. DEG testing (a,e,f) was performed with two-sided t-test. p-values were adjusted for multiple comparisons using the Benjamini-Hochberg method (Supp. Table 2). Illustrations in g,h were created using BioRender (https://biorender.com)./p>1). LR mean (mean expressions of the interacting ligand-receptor partners). b. Mean expression of glutamatergic signalling machinery genes (heatmap, upper). A schematic illustrates paracrine glutamatergic signalling involving P cells and NC2_glial_NGF+ (lower). c,d. Inferred spatial cell-cell interactions of LGICs in the node of SAN (b) or AVN (c) region, with P cell as the receiver. e. Plot of ‘pan-neuronal cytoskeleton score’ (Methods) in spatial coordinates matches RAGP (inset showing RAGP in the associated H&E image in Fig. 3e). f. Several GPCR ligands correlate with the pan-neuronal nerve cytoskeleton score. Correlation (Pearson’s r) of individual ligand genes with the pan-neuronal nerve cytoskeleton score (Methods). Ligand genes with p value < 0.05 and Pearson’s r > 0.1 are labelled. p-values were corrected for multiple testing using the Benjamini-Hochberg method. g. Plots of significantly correlated ligand genes in spatial coordinates. Illustrations in a-d were created using BioRender (https://biorender.com)./p>1). c. Images show abundances of plasma B cells (estimated using cell2location), mapping of IGHG1 and IGHA1 expression, and annotations of histological structures in spatial transcriptomic sections from the indicated anatomical regions. d. Workflow of spatial CellPhoneDB analysis focusing on B_plasma cells. e. Inferred spatial cell-cell interactions of TGFβ superfamily, spatially refined by niche partner cell states, with plasma B cells as the sender cell expressing ligands. LR mean (mean expressions of the interacting ligand-receptor partners). f. Dot plot showing TGFB1 expression in the cell states localised in the epicardial niches. g. Dot plot showing the expressions of ‘antimicrobial humoral response’ genes (Gene Ontology Term, GO:0019730) which were expressed significantly higher in mesothelial cells compared to other cells (p-value<0.05, log2FC>1). h. Expression of antimicrobial response genes, SLPI and RARRES2, in spatial transcriptomics data. DEG testing (b,g) was performed with two-sided wilcoxon test. p-values adjusted for multiple comparisons using the Benjamini-Hochberg method. Illustrations in e were created using BioRender (https://biorender.com)./p>

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